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猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

作者:佚名    文章来源:沙龙国际手机版    点击数:    更新时间:2014-4-24

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属的成员,根据抗原性及基因组成,分为PCVl和PCV2两种,其中PCV2对猪具有致病性,于1998年首次从患断奶后多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PM-WS)的病猪体内分离出来。近年来,猪圆环病毒病的发生呈上升趋势,加拿大、美国、法国、英国等国家都报道了PMWS的发生和流行,国内也不断有关于PCV2以及与其他病原体混合感染的报道。PCV2主要侵害免疫系统,导致感染猪免疫抑制,降低机体对其他病原体的抵抗力和疫苗的反应性,容易导致其他病毒和细菌的继发感染,使死亡率明显升高,给养猪业造成巨大的经济损失。

为了解该病在河北省尤其冀东地区及其临壤京津地区的流行情况,在2006年9月至2007年10月期间,采用间接ELISA方法对迁安、滦南、抚宁、廊坊、宁河、大兴等9个县(市)的22个猪场的398份猪血清检测了PCV2抗体并进行了分析,同时用PCR方法对部分样品进行了病原学检测。

1材料与方法

1.1待检血清样品

样品采自冀东、北京、天津部分地区的11个规模猪场和ll个散养户,共采集血清398份,其中繁殖母猪、后备母猪86份,种公猪17份,育肥猪149份,断奶仔猪146份。耳静脉或前腔静脉采血,分离血清,-20℃保存备用。

1.2主要试剂

猪圆环病毒病ELISA诊断试剂盒,购自华中农业大学动物医学院动物病毒研究室;蛋白酶K,购自Merck公司;Tris饱和酚,购自鼎国生物技术公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自北京天为时代科技有限公司。

1.3  引物

上游引物U:5 ’-AGT GAG CGG GAA AAT GCAGA-3’,下游引物L:5’-TCC TCC GTG GAT TGT TCTGT-3 ’,由上海生工生物技术有限公司合成。

1.4血清抗体的ELISA检测

按照猪圆环病毒病间接ELISA检测试剂盒说明进行抗体检测。

1.5血清样品中PCV2核酸的PCR检测

1.5.1 DNA的提取

从ELISA检测阳性的血清样品中随机取14份用于PCV2 DNA提取。DNA提取过程如下:取300

μL血清,加入等体积的组织裂解缓冲液,再加入蛋白酶K(20 mg/mL)至终浓度50μg/mL,于50℃消化2 h;取出消化产物,加入等体积的Tris饱和酚,充分振荡混匀后,4℃12 000 r/min,离心10 min;取上层水相500 μL转入l支1.5 mL Eppendorf管中,加入等体积的酚.氯仿.异戊醇混合液,混匀后,4℃12 000 r/min,离心10 min;取上层水相400 μL转入另1支1.5 mL Eppendorf管中,加入800μL预冷无水乙醇和3 mol/L NaAc(pH 5.2)40斗L,在一20℃放置l—2 h或室温放置30 min以沉淀病毒DNA;4 ℃ l2 000 r/min,离心10 min,弃去上清,用70%乙醇洗涤沉淀,自然干燥后溶于20汕灭菌蒸馏水中,立即用于PCR反应或一20℃保存备用。

1.5.2 PCR扩增

PCR反应体系为50μL,包括10×PCR缓冲液5μL,10 mmol/L dNTPs 4μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶lμL,25 pmol/L上、下游引物各1 μL;DNA模板3μL,无菌去离子水38μ L。PCR扩增条件为94℃预变性3 min;94℃变性45 S,56 ℃退火45 s,72℃延伸45 s,32个循环;72 ℃延伸l0min。DNA产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

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